Cinéaste, metteur en scène de théâtre et comédien, Hossein était le créateur de pièces de théâtre à grand spectacle et permettant l'interaction avec les spectateurs et son rôle de Joffrey de Peyrac dans les cinq films Angélique avec Michèle Mercier.

Fils du compositeur André Hossein et d'une mère pianiste, Robert Hossein suit très tôt des cours d'art dramatique auprès de René Simon, Tania Balachova ou Jean Marchat. Les Voyous est son premier succès théâtral. Robert Hossein a alors 19 ans. A la même époque, il met en scène Docteur Jekyll et Mister Hyde, La chair de l'orchidée d'après James Hadley Chase, ou bien encore L'homme traqué d'après Francis Caro. En 1948, il aborde le cinéma en commençant d'abord par faire quelques figurations, notamment dans le Le Diable boiteux de Sacha Guitry. Mais il est surtout lancé par le film de Jules Dassin, Du rififi chez les hommes. Par la suite, il interprète le personnage de Raskolnikov dans Crime et Chatiment, avant de donner la réplique à Brigitte Bardot dans Le Repos du guerrier ainsi qu'à la légendaire Sophia Loren dans Madame Sans-Gêne.

Dès 1955, il cumule les fonctions d'auteur, metteur en scène et acteur en réalisant son premier film : Les Salauds vont en enfer. Son style décalé apparaît dans cette première oeuvre ainsi que son goût pour le "film noir" américain. Son esprit novateur se confirme avec Pardonnez nos offenses qu'il réalise en 1956 et avec Toi le venin en 1959. Son rôle romantique et populaire dans Angélique marquise des anges ne l'empèche pas de collaborer à un cinéma plus intimiste tel La musica (Marguerite Duras, 1967). En 1968, il retrouve sa partenaire d'Angélique, Michèle Mercier, pour Une corde, un colt, entreprise originale de western français, qu'il réalise et interprète.

En plein succès cinématographique, Robert Hossein quitte la capitale en 1970 pour diriger le Théâtre Populaire de Reims. A travers 17 créations, il jette les bases d'un théâtre destiné au plus grand nombre, avec comme slogan : "du théâtre comme vous n'en verrez qu'au cinéma". De retour à Paris, il triomphe à maintes reprises, grâce à des spectacles où il développe une forme originale d'interaction avec le public : Le Cuirassé Potemkine, Notre-Dame de Paris, ou bien encore Danton et Robespierre. Parallèlement à ces mises en scène, il n'oublie par pour autant le cinéma, où les rôles se succèdent sans se ressembler, du Casse (Henri Verneuil, 1971) au film Les Uns et les Autres (Claude Lelouch, 1981), jusqu'à Vénus beauté (institut) de Tonie Marshall en 1998.

En 2003, il remplace Jean Yanne, décédé, qui devait interpréter le rôle d'un Ministre dans San Antonio. Il se dirige ensuite vers la télévision en interprétant le rôle du patriarche décédé dans Petits meurtres en famille (2006), une mini-série adaptée d'un roman d'Agatha Christie. Ce passage par la télévision n'est pas le premier puisque Robert Hossein s'était déjà essayé dans des feuilletons tels que Le Tour d'écrou (1974) ou encore La Croisade des enfants (1988). Son retour vers le grand écran se fait en 2007 avec La Disparue de Deauville, le premier thriller réalisé par Sophie Marceau.

Deux ans plus tard, Hossein croise Jean-Paul Belmondo dans Un homme et son chien et joue dans 2 épisodes de la saison 2 de la série Vénus et Apollon. Il reste ensuite dans l'univers de la télé en mettant en scène les téléfilms L'affaire Seznec en 2010 où Une femme nommée Marie en 2013. Grand défenseur du théâtre populaire, le comédien a rencontré le Pape François en personne en 2016 dans le but de promouvoir son art auprès du Vatican.